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    1. 医学Nanopore全长转录组测序

      产品介绍

      ONT全长转录组测序是指基于牛津纳米孔公司(Oxford Nanopore Technologies,ONT)三代测序平台进行全长转录组测序。

      全长转录组测序(full-length transcriptome sequencing),又称Isoform Sequencing(Iso-Seq),无需打断,基于三代测序平台直接获取转录本的5ˊ到3ˊ高质量全长序列,便于检测转录本结构变异。

      基于nanopore三代测序平台进行全长转录组测序,除了可准确鉴别转录本结构变异,还可准确定量转录本(mRNA或polyA+ lncRNA)表达水平。

      技术路线

      真核生物中约95%转录本具有可变剪接、65%具可变起始位点,以及70%以上转录本具有可选择性多聚腺苷酸APA现象,另外基因融合也是一种癌症驱动因素,这些表明转录本结构变异是调节基因表达多样性和产生蛋白质多样性的重要原因。

      产品参数

      建库策略 数据量 产品周期 样本要求
      polyA nanopore全长转录组文库 6Gb clean data以上 3个月 总量:≥3ug常规; 完整性:RIN值>8

      应用方向

      ?结果展示

      3
      lncRNA预测分析
      4
      转录本和基因差异表达分析
      1
      可变剪接分析-AS
      2
      可选择性多聚腺苷酸化分析-APA

      ?常见问题

      nanopore全长转录组测序与二代Illumina平台普通转录组的区别?

      主要在于测序平台不同。Illumina平台主要是PE150测序,构建小片段文库,为边合成边测序,在建库以及测序过程中均需要PCR扩增,主要用于基因水平表达定量及差异表达分析。nanopre全长转录组测序无需打断RNA,可获得5’到3’全长转录本序列及其表达信息,对片段大小无偏好,直接检测电信号无需边合成边测序其GC偏好性远低于二代平台;同时由于无需拼接其在转录本层面的结构变异检测方面,比如可变剪接、融合基因、APA、新基因预测等具有绝对优势。

      nanopore全长转录组测序送样要求?

      样品类型:PolyA RNA;样品浓度:≥50 ng/ul(Qubit HS RNA定量); 样品总量:cDNA-direct方式:>250ng(单次);总量>750 ng;(若提供总RNA,动物样品总量需按照PolyA RNA要求的100倍以上准备); cDNA-PCR方式:>1μg(单次);总量>3μg 样品纯度:OD260/280 ~2.0,OD260/230在2.0-2.2 之间,260nm处有正常峰值;样品无基因组DNA污染; 总RNA完整性: RIN值≥8.0,28S/18S≥1.0;图谱基线无上抬;5S峰正常。

      nanopore全长转录组测序一般建议多少个生物学重复?

      研究表明,生物学重复可提高所有基因表达水平鉴定的准确性,而增加测序深度主要提高低表达基因表达量鉴定准确性。每种处理条件下至少3个生物学重复,当研究样本的生物学差异比较高,或者想研究更多的微小表达差异/fold change时,需要更多生物学重复。也就是,比如对于个体差异较大的临床样本可以5-10个/组以上,而生物学差异较小的细胞系样本则每组3个生物学重复以上即可。

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